浙江农林柳参奎：AtVHA-d2通过调节质子流从而调控植物应对氧化应激丨NMT氧化胁迫创新科研平台

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

NMT作为生命科学关键核心技术，是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年，NMT已扎根中国15年。2020年，中国NMT销往瑞士苏黎世大学，正式打开欧洲市场。

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基本信息

主题：AtVHA-d2通过调节质子流从而调控植物应对氧化应激

期刊：BMC PLANT BIOL

研究使用平台：NMT氧化胁迫创新科研平台

影响因子：3.497

标题：Arabidopsis V-ATPase d2 subunit plays a role in plant responsesto oxidative stress

作者：浙江农林大学柳参奎、Shuang Feng

检测离子/分子指标

H⁺

检测样品

拟南芥伸长区

中文摘要（谷歌机翻）

     背景：液泡型H + -ATPase（V-ATPase）是位于内膜的多亚基质子泵，在植物生长中起重要作用。拟南芥V-ATPase d亚基由两个亚型组成，AtVHA-d1和AtVHA-d2。
     结果：本研究对AtVHA-d2基因的功能进行了研究。组织化学分析表明，AtVHA-d1和AtVHA-d2基因在拟南芥不同发育阶段的多个组织中普遍高度重叠表达。亚细胞定位表明AtVHA-d2主要定位于液泡。氧化应激显着诱导AtVHA-d2表达。此外，表型分析表明atvha-d2突变体对氧化应激敏感。非侵入式微测试测量结果表明，正常条件下atvha-d2根的净H⁺流入量弱于野生型，但是氧化胁迫导致atvha-d2根的H⁺流出量是与野生型明显不同。RNA-seq结合qPCR分析显示，在正常和氧化胁迫下，atvha-d2中质膜H + -ATPase基因（AtAHA）家族几个成员的表达与野生型显着不同。
     结论：总的来说，我们的结果表明AtVHA-d2通过影响H⁺通量和AtAHA基因表达而在拟南芥中对氧化应激作出反应。

离子/分子流实验处理方法
7日龄拟南芥幼苗（ Col-0和atvha-d2突变体）
（1）1/2 MS（control）
（2）1/2 MS+100 mM NaCl
（3）1/2 MS+2 mM H₂O₂（4）1/2 MS+200 mM mannitol培养24h

离子/分子流结果

在1/2MS培养基上观察到atvha-d2和Col-0幼苗根系H⁺内流，但atvha-d2的H⁺内流速率明显低于Col-0（图1A，B）。结果表明，atvha-d2根系的H⁺流速受到损害。此外，还比较了atvha-d2和Col-0根部在多种胁迫下的H⁺流速。与未处理的根（1/2MS培养基）相似，甘露醇处理对atvha-d2和Col-0根系的H⁺流速无明显影响。NaCl处理导致atvha-d2和Col-0根系H⁺外排，但两者之间无显著差异。在H₂O₂处理下，在Col-0根中观察到H⁺内流，但是在atvha-d2根中观察到H⁺流出（图1A，B）。结果表明，H₂O₂处理对atvha-d2根系H⁺流速有显著影响。

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其它实验结果

AtVHA-d1和AtVHAd2基因在植物组织中广泛表达，表现出重叠的表达模式。
GFP信号主要定位在稳定表达AtVHA-d2-GFP的拟南芥幼苗根细胞的液泡中。
AtVHA-d2可能在拟南芥对多种胁迫（冷、热、盐、渗透、氧化、ABA胁迫）的响应中发挥作用。
基因组PCR和测序分析显示，T-DNA插入到AtVHA-d2基因的第5外显子中。qPCR分析发现，atvha-d2的AtVHA-d2 mRNA水平约为Col-0的10%。然而，atvha-d2中AtVHA-d1 mRNA表达水平与Col-0相似。
添加NaCl、H₂O₂和甘露醇后，atvha-d2突变体的初生根长度通常低于Col-0。在H₂O₂和甘露醇胁迫下，atvha-d2幼苗的鲜重显著低于Col-0，并且在正常条件下没有显著差异。相对根长分析表明，H₂O₂对atvha-d2突变体初生根生长的抑制率显著高于Col-0。
在正常和氧化条件下，在atvha-d2突变体中相对于Col-0共鉴定出278个差异基因，在真核生物模块V型ATPase中显著富集，在该类别中只有AtVHA-d2下调表达。
AtVHA-d2表达的抑制导致了正常和氧化应激下AtAHA基因大多数成员表达的变化。