2018年1月10日 (三) 14:58的版本

1 系统运行准备
- 1.1 开关机注意事项
2 制备传感器
- 2.1 传感器开口与型号
- 2.2 LIX灌注注意事项
  - 2.2.1 LIX灌注长度
3 传感器校正
4 样品固定及观察
5 传感器定位
6 实际测量
7 其他系统操作
- 7.1 银丝氯化
- 7.2 分子传感器测试常见问题解答（请点击）
8 文献资料

系统运行准备

开关机注意事项

系统开机前要注意把稳压电源接入插线板的总开关打开，然后再逐一打开系统相关部件电源。
冬天由于气温低，空气干燥，开机前要打开空调和加湿器，将室内温度和湿度调节到合适范围（室温22℃-25℃，湿度50%-60%），同时操作者要穿上防静电服。
关机时要注意将各部件旋钮及开关放到正确的位置，方便下一次使用，还需要注意将三维运动位移平台的螺杆位置调节到中间，这样才能增加其使用寿命。最后不要忘记关闭总电源。

制备传感器

传感器开口与型号

传感器开口（尖端直径）很重要，传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及传感器的输入电阻，同时传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
目前，非损伤微测实验常用的传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。

传感器型号：
XY-CGQ-01（组织样品专用4-5 μm）
XY-CGQ-02（细胞样品专用1-2 μm）
XY-CGQ01（组织样品专用8-10 μm）

LIX灌注注意事项

LIX灌注长度

LIX的长度随传感器种类不同而不同，一般除K⁺、Cl^-和NO₃^-传感器外，LIX长度应在40-50μm，K⁺传感器180μm，Cl^-和NO₃^-传感器80μm；
灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
离子选择性微传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表

离子\项目	灌充液成分	离子交换剂	LIX灌充长度
H⁺	15 mM NaCl +40mM KH₂PO₄(pH 7.0)	XY-SJ-H	40-50μm
Ca²⁺	100 mM CaCl₂	XY-SJ-Ca	40-50μm
K⁺	100 mM KCl	XY-SJ-K	180μm
Na⁺	250 mM NaCl	XY-SJ-Na	40-50μm
Cl^-	100 mM KCl	XY-SJ-Cl	80μm
NH₄⁺	100 mM NH₄Cl	XY-SJ-NH4	40-50μm
NO₃^-	10 mM KNO₃	XY-SJ-NO3	80μm
Cd²⁺	10mM Cd(NO₃)₂+0.1mM KCl	XY-SJ-Cd	40-50μm
Mg²⁺	500mM MgCl₂	XY-SJ-Mg	40-50μm

传感器校正

什么是校正及校正的目的

NMT测试中的传感器校正指的是：将传感器放入已知离子浓度（不同浓度，2个或3个）的溶液中读取电压值，以Nernst方程为基础，建立浓度和电压的关系。
校正的目的主要有两个：

建立浓度和电压的线性关系，用于流速的计算。同时确定传感器是否正常工作。
保证测量结果的准确性。所以需要校正时必须校正。

正常情况下传感器在一次测试中最少需要校正2次，即测试开始前一次，结束时一次，有些特殊的传感器，例如Cl^-传感器，为了获得准确的数据，需要多次校正，这属于正常的校正。
校正和传感器漂移有关，漂移是一个持续的过程，一般来讲，当1价离子电位变化10mV以上,2价离子电位变化5mV以上时,需要再次校正。
有的数据在校正前后算得的流速差别很大，造成的原因是因为重新校正后，会得到新的斜率值和截距值，如果没有用新的斜率值和截距值计算数据的话，校正前后算出来的结果就会差的比较大，所以要特别注意。但是有时候，流速差别较大可能往往表现的正是活体样品真实的生理反应，所以样品的选择上要多注意。

校正时的注意事项

传感器不要碰底部，但最好深入液面较深处；参比电极和离子传感器的距离要保持相对固定，不要忽远忽近；在更换校正液之前冲洗参比电极。
H⁺需要将pH值换算成mM后再输入。
以下是常用离子/分子不同浓度校正液相对应的电位值的参考值，不同系统下会有一定偏差，但如果没有特殊情况，电位值应该在这个范围之内。

下表为校正液浓度为0.1mM时，各离子传感器电位的经验值。

离子	电位值
Na⁺	-90 mV— -50 mV
K⁺	-100 mV— -70 mV
NH₄⁺	-80 mV— -40 mV
Ca²⁺	-20 mV— +10 mV
Mg²⁺	-20 mV— +10 mV
Cd²⁺	+150 mV— +200 mV
NO₃^-	+280 mV— +350 mV
Cl^-	+200 mV— +250 mV
H⁺（pH6.0）	+150 mV— +200 mV

配制校正液

配制校正液时，最好采用先配制好较高浓度的母液，然后稀释的方法配制，不要直接溶解固体，因为校正液中的离子浓度一般较低（大多数是0.01mM～1mM），直接用固体配的话称量的量会很少，导致误差增大，校正时不能达到理想值。
每种离子的校正液要有一高一低两种浓度，原则上是要将测试液中该离子的浓度包含在内，一般高低浓度相差10倍，比如测试液中Na⁺是0.9mM，校正液就可以是0.5mM和5mM。H⁺的话原理一样，调节高低两种pH即可。
校正液中除了待测离子外，还应该有测试液中同浓度的其他离子，pH最好也和测试液一致，如果要测定多种离子，可以配制成同一瓶校正液，但校正液中的待测离子浓度要相应改变。
由于不同LIX的选择性不同，所以配制校正液时的离子浓度也是有要求的：

H⁺：pH4-pH9之间。
Na⁺：10mM—0.5mM，而且溶液中K⁺浓度不要高于Na⁺。
K⁺：10mM—0.05mM，且溶液中Na⁺浓度不要高于K⁺。
Ca²⁺：10mM—0.05mM，且溶液中最好没有Cd²⁺或者浓度低10倍以上。
Mg²⁺：10mM—0.1mM，且溶液中最好没有Cd²⁺和Ca²⁺或者浓度低10倍以上。
Cd²⁺：1mM—0.005mM，别的离子基本没什么影响。
NH₄⁺：10mM—0.05mM，电位可能不是很稳定，可以选用大开口传感器，如果测试中电位变化过大可以多校正或更换LIX。
NO₃^-：10mM—0.05mM，Cl^-浓度不要太高。
Cl^-：10mM—0.5mM，溶液中不能有其他阴离子，可能需要多次校正。

调节校正液的pH需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na⁺时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na⁺含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。

参比电极的使用及注意事项

非损伤微测系统中的参比电极主要有两个作用：

和传感器、测试液、前置放大器一起构成电路回路，
提供一个参考电位。

使用时要注意以下几点：

灌充溶液时，要将塑料管连接部分从后端拧下来，从后端用传感器灌充液的那种细的注射头灌充溶液，参比内液不要灌充太多，浸没过氯化银丝部分1cm即可。
新灌充3M KCl后，需要让氯化银丝在参比内液中浸泡24小时以上，这样电位稳定得快一些。
灌充溶液时，注意保护好内部银丝尖端的氯化银部分，不要私自用砂纸磨或者剪断。
每次使用完毕后，将参比电极浸泡在3MKCL溶液中（即收纳管内），不要暴露在空气中，如果长时间不使用，需要将塑料管中的溶液全部吸出，再用蒸馏水润洗几遍，晾干后保存。

当测试过程中出现电位不正常时，可以首先更换传感器（或LIX），排除传感器问题后，最有可能是参比电极的问题，大概有以下几种情况：

静态电位显示+-5.000V：检查参比电极接口是否插入前置放大器接口中，参比电极是否放入测试液中，参比电极中的溶液是否没过银丝尖端。
校正值在正常范围内，但是比起经验值偏大或偏小（比如低于-150mV,高于500mV等），首先确定测试液和传感器灌充液浓度是否正确，之后检查参比电极中的灌充液浓度是否正常，可以重新配制后重新灌充；如果还不行的话，可以更换参比电极的塑料管，新的参比电极附带一个备用的。
当电位变化很快时，除了传感器的电位漂移外，还有可能是参比电极漏液造成的，可以更换塑料管试试。

参比电极位置应尽量远离样品；最好深入液面5mm；测试时尽量将参比电极相对与样品的位置固定。

传感器校正常见问题解答（请点击）

样品固定及观察

显微镜放大倍数选择原则：

一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数。组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品相对较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。

传感器定位

测试时需保证传感器和样品距离的一致性

测试时传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小，尤其是信号大的样品，传感器距离样品的距离稍微不同，测出来的信号大小也就不一样，因而要保证每次测试时传感器与样品距离的一致性。

保证传感器与样品距离固定的方法

NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动，运动距离大小可以手动输入确定，显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽，测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置，让传感器稍稍贴住样品，然后朝所需方向移动传感器，从而达到精确定位的目的。

精确定位程度和显示的放大倍数有关，放大倍数越大越精确，目前可以达到40倍；还与传感器移动的最小距离有关，现在传感器移动最小可以精确到0.5um。

实际测量

分子传感器实际测试经验(请点击）

测定时的注意事项

请注意当一天中第一次测定时，建议将微传感器放入空白测试中进行5分钟的流速测定，观察测定数值，以确保测定数值应在基线附近。
可能在初始测定时会遇到增强的干扰信号和瞬时人工信号。如果传感器是好的，运行几分钟，它就会稳定下来。如果半个小时后还未稳定，请更换一支新传感器。
如果测试中出现电位在测试液中严重漂移的情况（一价离子电位变化在±10mv以上；二价离子电位变化在±5mv以上），需要重新进行传感器校正，并在测试记录表上进行相应的记录。
测试开始时接近样品出现较大波动，此时可以依次更换另一个测试点、更换测试液；波动仍然存在，更换空白测试液测定；若没有波动，说明可能是样品问题，更换新样品。
如果一开始测定时没问题，测试过程中出现波动，大多数是样品或溶液本身造成的，可按上述步骤检测和排除问题。
测试时需要瞬时处理时需要注意，要标记为“add NaCl”，不要标记成“+NaCl”，因为在用EXCEL打开时，单元格中的内容不能显示“+NaCl”，会报错，而“add NaCl”可以显示，不会报错。
离子是外流还是内流，以原始数据中的dV判断最为准确。

极谱分子传感器测试

对于极谱分子传感器而言，“Raw A/D”模式下显示的数值实际是电流值，单位是“nA”。

原点电位问题

测试的时候，测的是K⁺，发现K⁺有个比较大的吸收，但背景电位却是上升的，会出现这种情况，可能是样品在测试前处在一个K⁺含量比较高的环境下，在测试时又没有在测试液中平衡一定时间，所以导致样品周围K⁺含量较测试液高，而样品对溶液中的K+是吸收趋势，最后才导致这种结果。
也可能是样品大部分的区域对K⁺都是外排趋势，导致样品周围整体电位升高，但是测得点确是吸收趋势，也可能导致这种结果。
如果传感器远离样品时电位恢复，建议先用蒸馏水多冲洗一下样品，平衡时间加长（≈30min）并且更换几次测试液。
如果还不行的话，就看看每个样品测试时电位是否变化较大，保证每个样品电位基本一致，也可以继续测试。
测试中加入某些药品，尤其是有机物，会对LIX有较大影响，电位会变化很多，需要多加注意！
测试前最好做一个空白对照加入药品的实验，如果电位上没有太大变化，可以直接瞬时处理；如果变化较大的话，根据测试需要，建议采取预处理的办法。

注意小键盘按键

系统操作时方向键上下左右、home/end是三维三个方向的操作键。如果小键盘的numlock灯亮起时，小键盘的数字键就是数字键，输入数字时可以使用；如果numlock灯灭了的状态，4、6（左右）、2、8（上下）、7（home）、1（end）就等于是三维操作运动控制的键盘方向键。
在操作时注意如果numlock灯熄灭时别误操作数字键。

实际测量常见问题解答（请点击）

其他系统操作

银丝氯化

用来氯化的电解液的浓度不能太高，用0.1M HCl/KCl即可。
氯化的时间适中，30s即可，时间太短氯化效果不好，太长可能会将银丝弄断。
电池电力不足会导致银丝氯化效果不好。

分子传感器测试常见问题解答（请点击）

文献资料

常用测试液

文件:NISC测试标准使用版 v1.2.xlsx

非损伤微测技术文章撰写参考资料

非损伤微测技术文章撰写参考资料_V5.0——联盟版.pdf

文章撰写资料试剂耗材型号发表的文献

文件:C2015-001-Overexpression of bacterial c-glutamylcysteine synthetase.pdf

传感器工作原理文献

文献里介绍了Ca2+传感器结构、组成、LIX如何工作，流速如何测定等等基本问题

媒体文件:Construction,_Theory_and_Practical_Considerations_for_using_Self-Referencing_of_Ca2+-Selective_Microelectrodes_for_Monitoring_Extracellular_Ca2+_Gradients.pdf ‎

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 =文献资料=
 ==常用测试液==
-[[文件:NISC测试标准_使用版_v1.2.xlsx|常用测试液.xlsx]]
+[[文件:NISC测试标准_使用版_v1.2.xlsx]]
 ==非损伤微测技术文章撰写参考资料==

“NMT系统使用经验”的版本间的差异