NMT系统使用经验
来自NMT百科
系统运行准备
开关机注意事项
- 系统开机前要注意把稳压电源接入插线板的总开关打开，然后再逐一打开系统相关部件电源。
- 冬天由于气温低，空气干燥，开机前要打开空调和加湿器，将室内温度和湿度调节到合适范围（室温22℃-25℃，湿度50%-60%），同时操作者要穿上防静电服。
- 关机时要注意将各部件旋钮及开关放到正确的位置，方便下一次使用，还需要注意将三维运动位移平台的螺杆位置调节到中间，这样才能增加其使用寿命。最后不要忘记关闭总电源。
制备流速传感器
流速传感器开口与型号
- 流速传感器开口（尖端直径）很重要，流速传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及流速传感器的输入电阻，同时流速传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
- 目前，非损伤微测实验常用的流速传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。
流速传感器型号：
XY-CGQ-01（组织样品专用4-5 μm）
XY-CGQ-02（细胞样品专用1-2 μm）
XY-CGQ01（组织样品专用8-10 μm）
LIX灌注注意事项
LIX灌注长度
- LIX的长度随流速传感器种类不同而不同，一般除K+、Cl-和NO3-流速传感器外，LIX长度应在40-50μm，K+流速传感器180μm，Cl-和NO3-流速传感器80μm；
- 灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，流速传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
- 离子选择性微流速传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表
| 离子\项目 | 灌充液成分 | 离子交换剂 | LIX灌充长度 |
|---|---|---|---|
| H+ | 15 mM NaCl +40mM KH2PO4(pH 7.0) | XY-SJ-H | 40-50μm |
| Ca2+ | 100 mM CaCl2 | XY-SJ-Ca | 40-50μm |
| K+ | 100 mM KCl | XY-SJ-K | 180μm |
| Na+ | 250 mM NaCl | XY-SJ-Na | 40-50μm |
| Cl- | 100 mM KCl | XY-SJ-Cl | 80μm |
| NH4+ | 100 mM NH4Cl | XY-SJ-NH4 | 40-50μm |
| NO3- | 10 mM KNO3 | XY-SJ-NO3 | 80μm |
| Cd2+ | 10mM Cd(NO3)2+0.1mM KCl | XY-SJ-Cd | 40-50μm |
| Mg2+ | 500mM MgCl2 | XY-SJ-Mg | 40-50μm |
流速传感器校正
什么是校正及校正的目的
- NMT测试中的流速传感器校正指的是：将流速传感器放入已知离子浓度（不同浓度，2个或3个）的溶液中读取电压值，以Nernst方程为基础，建立浓度和电压的关系。
- 校正的目的主要有两个：
- 建立浓度和电压的线性关系，用于流速的计算。同时确定流速传感器是否正常工作。
- 保证测量结果的准确性。所以需要校正时必须校正。
- 正常情况下流速传感器在一次测试中最少需要校正2次，即测试开始前一次，结束时一次，有些特殊的流速传感器，例如Cl-流速传感器，为了获得准确的数据，需要多次校正，这属于正常的校正。
- 校正和流速传感器漂移有关，漂移是一个持续的过程，一般来讲，当1价离子电位变化10mV以上,2价离子电位变化5mV以上时,需要再次校正。
- 有的数据在校正前后算得的流速差别很大，造成的原因是因为重新校正后，会得到新的斜率值和截距值，如果没有用新的斜率值和截距值计算数据的话，校正前后算出来的结果就会差的比较大，所以要特别注意。但是有时候，流速差别较大可能往往表现的正是活体样品真实的生理反应，所以样品的选择上要多注意。
校正时的注意事项
- 流速传感器不要碰底部，但最好深入液面较深处；参比电极和离子流速传感器的距离要保持相对固定，不要忽远忽近；在更换校正液之前冲洗参比电极。
- H+需要将pH值换算成mM后再输入。
- 以下是常用离子/分子不同浓度校正液相对应的电位值的参考值，不同系统下会有一定偏差，但如果没有特殊情况，电位值应该在这个范围之内。
下表为校正液浓度为0.1mM时，各离子传感器电位的经验值。
| 离子 | 电位值 |
|---|---|
| Na+ | -90 mV— -50 mV |
| K+ | -100 mV— -70 mV |
| NH4+ | -80 mV— -40 mV |
| Ca2+ | -20 mV— +10 mV |
| Mg2+ | -20 mV— +10 mV |
| Cd2+ | +150 mV— +200 mV |
| NO3- | +280 mV— +350 mV |
| Cl- | +200 mV— +250 mV |
| H+（pH6.0） | +150 mV— +200 mV |
配制校正液
- 配制校正液时，最好采用先配制好较高浓度的母液，然后稀释的方法配制，不要直接溶解固体，因为校正液中的离子浓度一般较低（大多数是0.01mM～1mM），直接用固体配的话称量的量会很少，导致误差增大，校正时不能达到理想值。
- 每种离子的校正液要有一高一低两种浓度，原则上是要将测试液中该离子的浓度包含在内，一般高低浓度相差10倍，比如测试液中Na+是0.9mM，校正液就可以是0.5mM和5mM。H+的话原理一样，调节高低两种pH即可。
- 校正液中除了待测离子外，还应该有测试液中同浓度的其他离子，pH最好也和测试液一致，如果要测定多种离子，可以配制成同一瓶校正液，但校正液中的待测离子浓度要相应改变。
- 由于不同LIX的选择性不同，所以配制校正液时的离子浓度也是有要求的：
- H+：pH4-pH9之间。
- Na+：10mM—0.5mM，而且溶液中K+浓度不要高于Na+。
- K+：10mM—0.05mM，且溶液中Na+浓度不要高于K+。
- Ca2+：10mM—0.05mM，且溶液中最好没有Cd2+或者浓度低10倍以上。
- Mg2+：10mM—0.1mM，且溶液中最好没有Cd2+和Ca2+或者浓度低10倍以上。
- Cd2+：1mM—0.005mM，别的离子基本没什么影响。
- NH4+：10mM—0.05mM，电位可能不是很稳定，可以选用大开口流速传感器，如果测试中电位变化过大可以多校正或更换LIX。
- NO3-：10mM—0.05mM，Cl-浓度不要太高。
- Cl-：10mM—0.5mM，溶液中不能有其他阴离子，可能需要多次校正。
- 调节校正液的pH需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na+时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na+含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。
参比电极的使用及注意事项
- 非损伤微测系统中的参比电极主要有两个作用：
- 和流速传感器、测试液、前置放大器一起构成电路回路，
- 提供一个参考电位。
- 使用时要注意以下几点：
- 灌充溶液时，要将塑料管连接部分从后端拧下来，从后端用流速传感器灌充液的那种细的注射头灌充溶液，参比内液不要灌充太多，浸没过氯化银丝部分1cm即可。
- 新灌充3M KCl后，需要让氯化银丝在参比内液中浸泡24小时以上，这样电位稳定得快一些。
- 灌充溶液时，注意保护好内部银丝尖端的氯化银部分，不要私自用砂纸磨或者剪断。
- 每次使用完毕后，将参比电极浸泡在3MKCL溶液中（即收纳管内），不要暴露在空气中，如果长时间不使用，需要将塑料管中的溶液全部吸出，再用蒸馏水润洗几遍，晾干后保存。
- 当测试过程中出现电位不正常时，可以首先更换传感器（或LIX），排除传感器问题后，最有可能是参比电极的问题，大概有以下几种情况：
- 静态电位显示+-5.000V：检查参比电极接口是否插入前置放大器接口中，参比电极是否放入测试液中，参比电极中的溶液是否没过银丝尖端。
- 校正值在正常范围内，但是比起经验值偏大或偏小（比如低于-150mV,高于500mV等），首先确定测试液和流速传感器灌充液浓度是否正确，之后检查参比电极中的灌充液浓度是否正常，可以重新配制后重新灌充；如果还不行的话，可以更换参比电极的塑料管，新的参比电极附带一个备用的。
- 当电位变化很快时，除了流速传感器的电位漂移外，还有可能是参比电极漏液造成的，可以更换塑料管试试。
- 参比电极位置应尽量远离样品；最好深入液面5mm；测试时尽量将参比电极相对与样品的位置固定。
流速传感器校正常见问题解答（请点击）
样品固定及观察
- 显微镜放大倍数选择原则：
一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数。组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品相对较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。
流速传感器定位
- 测试时需保证流速传感器和样品距离的一致性
- 测试时流速传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小，尤其是信号大的样品，流速传感器距离样品的距离稍微不同，测出来的信号大小也就不一样，因而要保证每次测试时流速传感器与样品距离的一致性。
- 保证流速传感器与样品距离固定的方法
- NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动，运动距离大小可以手动输入确定，显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽，测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置，让流速传感器稍稍贴住样品，然后朝所需方向移动流速传感器，从而达到精确定位的目的。
- 精确定位程度和显示的放大倍数有关，放大倍数越大越精确，目前可以达到40倍；还与流速传感器移动的最小距离有关，现在流速传感器移动最小可以精确到0.5um。
实际测量
分子流速传感器实际测试经验(请点击）
测定时的注意事项
- 请注意当一天中第一次测定时，建议将微流速传感器放入空白测试中进行5分钟的流速测定，观察测定数值，以确保测定数值应在基线附近。
- 可能在初始测定时会遇到增强的干扰信号和瞬时人工信号。如果流速传感器是好的，运行几分钟，它就会稳定下来。如果半个小时后还未稳定，请更换一支新流速传感器。
- 如果测试中出现电位在测试液中严重漂移的情况（一价离子电位变化在±10mv以上；二价离子电位变化在±5mv以上），需要重新进行流速传感器校正，并在测试记录表上进行相应的记录。
- 测试开始时接近样品出现较大波动，此时可以依次更换另一个测试点、更换测试液；波动仍然存在，更换空白测试液测定；若没有波动，说明可能是样品问题，更换新样品。
- 如果一开始测定时没问题，测试过程中出现波动，大多数是样品或溶液本身造成的，可按上述步骤检测和排除问题。
- 测试时需要瞬时处理时需要注意，要标记为“add NaCl”，不要标记成“+NaCl”，因为在用EXCEL打开时，单元格中的内容不能显示“+NaCl”，会报错，而“add NaCl”可以显示，不会报错。
- 离子是外流还是内流，以原始数据中的dV判断最为准确。
- 极谱分子流速传感器测试
- 对于极谱分子流速传感器而言，“Raw A/D”模式下显示的数值实际是电流值，单位是“nA”。
原点电位问题
- 测试的时候，测的是K+，发现K+有个比较大的吸收，但背景电位却是上升的，会出现这种情况，可能是样品在测试前处在一个K+含量比较高的环境下，在测试时又没有在测试液中平衡一定时间，所以导致样品周围K+含量较测试液高，而样品对溶液中的K+是吸收趋势，最后才导致这种结果。
- 也可能是样品大部分的区域对K+都是外排趋势，导致样品周围整体电位升高，但是测得点确是吸收趋势，也可能导致这种结果。
- 如果流速传感器远离样品时电位恢复，建议先用蒸馏水多冲洗一下样品，平衡时间加长（≈30min）并且更换几次测试液。
- 如果还不行的话，就看看每个样品测试时电位是否变化较大，保证每个样品电位基本一致，也可以继续测试。
- 测试中加入某些药品，尤其是有机物，会对LIX有较大影响，电位会变化很多，需要多加注意！
- 测试前最好做一个空白对照加入药品的实验，如果电位上没有太大变化，可以直接瞬时处理；如果变化较大的话，根据测试需要，建议采取预处理的办法。
注意小键盘按键
- 系统操作时方向键上下左右、home/end是三维三个方向的操作键。如果小键盘的numlock灯亮起时，小键盘的数字键就是数字键，输入数字时可以使用；如果numlock灯灭了的状态，4、6（左右）、2、8（上下）、7（home）、1（end）就等于是三维操作运动控制的键盘方向键。
- 在操作时注意如果numlock灯熄灭时别误操作数字键。
实际测量常见问题解答（请点击）
其他系统操作
银丝氯化
- 用来氯化的电解液的浓度不能太高，用0.1M HCl/KCl即可。
- 氯化的时间适中，30s即可，时间太短氯化效果不好，太长可能会将银丝弄断。
- 电池电力不足会导致银丝氯化效果不好。
分子流速传感器测试常见问题解答（请点击）
文献资料
常用测试液
数据处理分析
文件:数据分析处理流程（imFluxes V2.0）.pdf
非损伤微测技术文章撰写参考资料
文件:非损伤微测技术文章撰写参考资料 V5.2——联盟版.pdf
文章撰写资料试剂耗材型号发表的文献
文件:C2015-001-Overexpression of bacterial c-glutamylcysteine synthetase.pdf
流速传感器工作原理文献
文献里介绍了Ca2+流速传感器结构、组成、LIX如何工作，流速如何测定等等基本问题
