“样品固定”的版本间的差异
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2016年12月28日 (三) 13:38的版本
目录
大致分类
- 一般来说，长度大于5mm]的样品，就可以使用滤纸条+树脂块的方法进行固定；
- 1-5mm]的样品，则可以使用双面胶或生物胶将其固定在皿底；
- 样品直径小于1mm，如柱头甚至单细胞等，则使用旭月提供的样品固定拨片（阳离子黏附载玻片）进行黏附固定。
详细样品固定方法
植物根、茎
- 本篇以水稻幼苗根部为例，两周龄的水稻幼苗，根部呈白色，长度不超过10cm。
- 准备工具：塑料培养皿、滤纸、树脂块、剪刀、镊子。
- 具体步骤：
- 1. 用剪刀将滤纸剪成相同大小的长条（大小根据样品及所选取的培养皿大小来定），之后浸入盛放有测试液的培养皿中，树脂块也一并放进去，进行平衡。
- 2. 将样品放入测试液中平衡一段时间，具体时间根据情况而定，一般在10min-15min。
- 3. 用镊子把一条滤纸平放到培养皿底部，将样品放到滤纸上，再用一条滤纸盖住样品。
- 这里需要注意：
- （1） 样品需要测定的位置要露出来，而且尽量露出的少一些，否则在测试中样品可能也会有轻微的飘动，可以用镊子轻拉样品来调节。
- （2） 样品露出的位置尽量靠近培养皿中部，可以帮助工程师更好的调节电极的位置。
- （3） 操作过程中尽量不要碰到需要测定的根部，以免损伤样品。
- 4. 为了防止加入溶液后样品飘动，可以用树脂块压住滤纸来固定住样品，需要注意的是最好不要将树脂块直接压在样品上，尤其是压在需要测试的位置上。
- 5. 像水稻这种整体不是很长的样品，可以将其剩余部分盘绕在培养皿中，但是不要挡住需要测定的部位，最后用滴管向培养皿中缓慢加入测试液，直接倒的话可能会把样品冲跑，测试液的量需要没过样品3-5mm，之后就可以拿来测试了。
植物叶片（如：保卫细胞等）
（一）镊子撕取法（适用于叶片较大的植物，例如烟草）
- 准备工具：培养皿、镊子、双面胶、剪刀、毛笔（或小刷子）等。
- 具体步骤：
- 1. 剪一小块双面胶粘在干燥的塑料培养皿底待用，面积不宜太大。
- 2. 用镊子撕取表皮条（下表皮）。撕取下的表皮条需要一部分透明，另一部分留有绿色叶片用于粘连固定样品。
- 一般情况下，只要肉眼能看见透明的表皮条，其上就会存在待测的保卫细胞，不宜太大，太大容易卷曲。
- 3. 将带有透明表皮条的叶片部分粘在双面胶上，透明表皮部分露在双面胶之外。为了使得表皮条跟皿之间能够紧贴，可在远离双面胶的地方滴一小滴测试液，粘之前让表皮吸附一些液体（绿色叶片部分尽量不要粘液体），靠张力将表皮条吸在皿底。
- 4. 用湿毛笔轻轻刷去表皮条表面的叶肉细胞。
- 5. 加入测试液平衡一段时间（一般为10～15min）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。如果加入测试液后表皮条漂起，再用毛笔轻轻刷一下并更换新鲜的测试液。
（二）胶带粘贴撕取法（适用于叶片较小的植物，例如拟南芥）
- 准备工具：培养皿、深色绝缘胶带、白色透明胶带（Magic Tape）、剪刀等。
- 具体步骤：
- 1．剪取叶片将叶片上表面粘贴在深色绝缘胶带上，并使用剪刀适当修剪叶片边缘。
- 2．将白色透明胶带边缘剪取一个小的缺口，注意缺口的大小，过大过小都不利于获取叶片的保卫细胞。
- 3. 使用白色透明胶带带有缺口的地方粘贴叶片的下表皮。
- 4. 将白色透明胶带撕下，利用两个胶带的粘贴力可以获取叶片下表皮的保卫细胞。
- 5. 将撕取的样品粘贴固定到干净的培养皿中。
- 6. 加入测试液平衡一段时间（10～15min）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。
细胞及微生物
- 可以使用此类方法的样品实际上有很多种，例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡，单细胞藻类、细菌、酵母菌，再或是花粉粒、花粉管等，固定时整体上遵循一个原则：不管样品是贴壁还是悬浮，需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。本篇以豌豆根部边缘细胞为例。
- 准备工具：塑料培养皿，旭月公司提供的固定样品玻片，移液枪及枪头，镊子，测试液等。
- 具体步骤：
- 1. 取一个干净的培养皿，用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液，然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部，防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。
- 2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液（具体量依样品而定，一般为100uL-200uL），滴到玻片中间位置，涂抹均匀，然后静置5-10min，使样品能充分被玻片吸附住。
- 3. 用移液枪吸取一定量测试液，先用镊子轻轻压住玻片边缘，再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液，防止玻片漂起来，加入的测试液必须完全没过玻片。
- 4. 同样沿培养皿边缘用移液枪（或滴管）将皿中测试液吸出（将漂浮的细胞冲掉），然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。
- 注意以下事项：
- 1. 尽量将样品在玻片上涂抹开，让样品充分接触到玻片，这样才能起到作用。
- 2. 加溶液时，一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来，在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方，无法测试。所以不仅要按住玻片边缘，更要缓缓加入溶液。
- 3. 吸取溶液时同样要缓缓的，并且不要伸到液面最低端吸取，这样容易将样品吸走。
植物种子与类似形状的样品
- 本篇以大豆为例。
- 准备工具：培养皿、胶带、镊子等。
- 具体步骤：取一个干燥的培养皿，将胶布剪成小条，用胶布将大豆种子粘到皿底，再加入测试液即可。
- 需要注意：
- 1. 胶布根据样品大小尽量剪的细且短一些，可以多粘几条但是粘的位置离测定点尽量远一些，样品固定好后需要在测试液中平衡时间长一些（尤其是测定H+），以尽可能的减少胶布对溶液中离子流的影响。
- 2. 小一些的样品（如榆树种子或是米粒）可以不用胶布，采用双面胶或是生物胶将样品粘在皿底就可以了，注意粘样品时待测部位的位置要便于测试。粘好之后再按常规进行样品的平衡，即可进行测试。
适于体视镜检测的样品
- 对于测试鸡蛋、植物果实、合金等不透光的样品来说，倒置显微镜无法满足NMT技术的测试要求，需要使用体视显微镜来进行测试。此类样品的固定方法比较特殊。本篇以柑橘果实为例，展示体视镜测试中样品的固定方法。
- 准备工具：将离心管盖或者其它大小适中的盖状容器打孔后的器具、胶水（不影响测试即可）、移液枪等。
适于体视镜检测的样品
- 具体步骤：
- 1. 根据测试部位，将待测部位露出，使用移液枪在测试样品表面或者离心管盖子底部涂抹适量的胶水。
- 2. 将离心管盖固定在待测样品上，固定时可根据情况在胶水少的部位再添加一些胶水，或是用胶水将离心管盖与样品链接缝处粘住，静止一段时间待胶水晾干。
- 3. 加入蒸馏水冲洗，目的是将胶水表面的物质冲掉，避免对测试信号产生影响。并检查粘贴后的器具是否漏水，如发现漏水则需要重新进行固定。
- 4. 加入测试液平衡一段时间（一般为10-15min）后倒掉，再加入新鲜的测试液即可进行测试。
