样品固定

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Menglu讨论 | 贡献2016年12月28日 (三) 15:09的版本

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大致分类

  • 一般来说,长度大于5mm的样品,就可以使用滤纸条+树脂块的方法进行固定;
  • 1-5mm的样品,则可以使用双面胶或生物胶将其固定在皿底;
  • 样品直径小于1mm,如柱头甚至单细胞等,则使用旭月提供的样品固定拨片(阳离子黏附载玻片)进行黏附固定。

详细样品固定方法

植物根、茎

  • 本篇以水稻幼苗根部为例,两周龄的水稻幼苗,根部呈白色,长度不超过10cm。
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准备工具:塑料培养皿、滤纸、树脂块、剪刀、镊子。
具体步骤:

1. 用剪刀将滤纸剪成相同大小的长条(大小根据样品及所选取的培养皿大小来定),之后浸入盛放有测试液的培养皿中,树脂块也一并放进去,进行平衡。
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2. 将样品放入测试液中平衡一段时间,具体时间根据情况而定,一般在10min-15min。
3. 用镊子把一条滤纸平放到培养皿底部,将样品放到滤纸上,再用一条滤纸盖住样品。

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这里需要注意:
(1) 样品需要测定的位置要露出来,而且尽量露出的少一些,否则在测试中样品可能也会有轻微的飘动,可以用镊子轻拉样品来调节。
(2) 样品露出的位置尽量靠近培养皿中部,可以帮助工程师更好的调节电极的位置。
(3) 操作过程中尽量不要碰到需要测定的根部,以免损伤样品。
4. 为了防止加入溶液后样品飘动,可以用树脂块压住滤纸来固定住样品,需要注意的是最好不要将树脂块直接压在样品上,尤其是压在需要测试的位置上。

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5. 像水稻这种整体不是很长的样品,可以将其剩余部分盘绕在培养皿中,但是不要挡住需要测定的部位,最后用滴管向培养皿中缓慢加入测试液,直接倒的话可能会把样品冲跑,测试液的量需要没过样品3-5mm,之后就可以拿来测试了。
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植物叶片(如:保卫细胞等)

(一)镊子撕取法(适用于叶片较大的植物,例如烟草)

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准备工具:培养皿、镊子、双面胶、剪刀、毛笔(或小刷子)等。
具体步骤:
1. 剪一小块双面胶粘在干燥的塑料培养皿底待用,面积不宜太大。
2. 用镊子撕取表皮条(下表皮)。撕取下的表皮条需要一部分透明,另一部分留有绿色叶片用于粘连固定样品。
一般情况下,只要肉眼能看见透明的表皮条,其上就会存在待测的保卫细胞,不宜太大,太大容易卷曲。
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3. 将带有透明表皮条的叶片部分粘在双面胶上,透明表皮部分露在双面胶之外。为了使得表皮条跟皿之间能够紧贴,可在远离双面胶的地方滴一小滴测试液,粘之前让表皮吸附一些液体(绿色叶片部分尽量不要粘液体),靠张力将表皮条吸在皿底。
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4. 用湿毛笔轻轻刷去表皮条表面的叶肉细胞。
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5. 加入测试液平衡一段时间(一般为10~15min)后倒掉,由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂,在平衡过程中可以多更换几次测试液,以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。如果加入测试液后表皮条漂起,再用毛笔轻轻刷一下并更换新鲜的测试液。


(二)胶带粘贴撕取法(适用于叶片较小的植物,例如拟南芥)

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准备工具:培养皿、深色绝缘胶带、白色透明胶带(Magic Tape)、剪刀等。
具体步骤:
1.剪取叶片将叶片上表面粘贴在深色绝缘胶带上,并使用剪刀适当修剪叶片边缘。
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2.将白色透明胶带边缘剪取一个小的缺口,注意缺口的大小,过大过小都不利于获取叶片的保卫细胞。
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3. 使用白色透明胶带带有缺口的地方粘贴叶片的下表皮。
4. 将白色透明胶带撕下,利用两个胶带的粘贴力可以获取叶片下表皮的保卫细胞。
  5. 将撕取的样品粘贴固定到干净的培养皿中。
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  6. 加入测试液平衡一段时间(10~15min)后倒掉,由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂,在平衡过程中可以多更换几次测试液,以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。


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细胞及微生物

  • 可以使用此类方法的样品实际上有很多种,例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡,单细胞藻类、细菌、酵母菌,再或是花粉粒、花粉管等,固定时整体上遵循一个原则:不管样品是贴壁还是悬浮,需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。本篇以豌豆根部边缘细胞为例。


准备工具:塑料培养皿,旭月公司提供的固定样品玻片,移液枪及枪头,镊子,测试液等。
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具体步骤:
1. 取一个干净的培养皿,用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液,然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部,防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。
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2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液(具体量依样品而定,一般为100uL-200uL),滴到玻片中间位置,涂抹均匀,然后静置5-10min,使样品能充分被玻片吸附住。
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3. 用移液枪吸取一定量测试液,先用镊子轻轻压住玻片边缘,再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液,防止玻片漂起来,加入的测试液必须完全没过玻片。
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4. 同样沿培养皿边缘用移液枪(或滴管)将皿中测试液吸出(将漂浮的细胞冲掉),然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。
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注意以下事项:
1. 尽量将样品在玻片上涂抹开,让样品充分接触到玻片,这样才能起到作用。
2. 加溶液时,一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来,在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方,无法测试。所以不仅要按住玻片边缘,更要缓缓加入溶液。
3. 吸取溶液时同样要缓缓的,并且不要伸到液面最低端吸取,这样容易将样品吸走。


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植物种子与类似形状的样品

  • 本篇以大豆为例。


准备工具:培养皿、胶带、镊子等。
具体步骤:取一个干燥的培养皿,将胶布剪成小条,用胶布将大豆种子粘到皿底,再加入测试液即可。
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需要注意:
1. 胶布根据样品大小尽量剪的细且短一些,可以多粘几条但是粘的位置离测定点尽量远一些,样品固定好后需要在测试液中平衡时间长一些(尤其是测定H+),以尽可能的减少胶布对溶液中离子流的影响。
  2. 小一些的样品(如榆树种子或是米粒)可以不用胶布,采用双面胶或是生物胶将样品粘在皿底就可以了,注意粘样品时待测部位的位置要便于测试。粘好之后再按常规进行样品的平衡,即可进行测试。


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适于体视镜检测的样品

  • 对于测试鸡蛋、植物果实、合金等不透光的样品来说,倒置显微镜无法满足NMT技术的测试要求,需要使用体视显微镜来进行测试。此类样品的固定方法比较特殊。本篇以柑橘果实为例,展示体视镜测试中样品的固定方法。


准备工具:将离心管盖或者其它大小适中的盖状容器打孔后的器具、胶水(不影响测试即可)、移液枪等。

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具体步骤:
1. 根据测试部位,将待测部位露出,使用移液枪在测试样品表面或者离心管盖子底部涂抹适量的胶水。
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2. 将离心管盖固定在待测样品上,固定时可根据情况在胶水少的部位再添加一些胶水,或是用胶水将离心管盖与样品链接缝处粘住,静止一段时间待胶水晾干。
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3. 加入蒸馏水冲洗,目的是将胶水表面的物质冲掉,避免对测试信号产生影响。并检查粘贴后的器具是否漏水,如发现漏水则需要重新进行固定。
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4. 加入测试液平衡一段时间(一般为10-15min)后倒掉,再加入新鲜的测试液即可进行测试。
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