转自转录组

 

导读

 

       CircRNAs在调节基因功能方面起着至关重要的作用，目前对circRNAs在植物中的了解仍然有限，特别是准确识别和种间差异的问题。本研究利用Find_circ软件开发了一种新的算法，显著提高了植物circRNA鉴定的效率。研究人员利用这套算法进行了circRNA的鉴定，并从盐胁迫和非盐胁迫三个杨树种四个组织的108个特异转录本中鉴定了差异circRNA。杨树中的circRNA大多来源于外显子区域，由较长的侧翼内含子序列诱导，并在特定的组织/物种中低水平表达。大多数circRNA的起源是物种特异性的，或者相对于亲本基因来说是适度保守的，甚至是从不同的同源基因位点产生的。大多数circRNA在盐敏感和耐盐杨树中的表达模式和功能也有很大差异。在胡杨中发现了15个含有miRNA结合位点的circRNAs响应盐胁迫。这些结果表明，circRNAs可以调控木本杨树的基因表达，突出了circRNAs在不同杨树耐盐性中的潜在调控功能。

 

 

原名：Contrasting origins, expression patterns and functions of circRNAs between salt-sensitive and salt-tolerant poplars

译名：盐敏感和耐盐杨树circRNA的来源、表达模式和功能比较

期刊：Environmental and Experimental Botany

IF：4.027

发表时间：2021年1月

通讯作者：万东石

通讯作者单位：兰州大学生命科学学院

DOI号：10.1016/j.envexpbot.2021.104403

 

 

实验设计

 

 

 

结果

 

 

1   新方法鉴定杨树中的circRNA

 

       将对照组和盐处理组的不同组织部位（叶，韧皮部，木质部和根）进行高通量测序，得到31.4亿125bp双端数据。结合胡杨和白杨在相同条件下处理的转录组数据，对3个杨树的108个RNA序列进行了下游分析。首先对转录组数据进行组装，得到三种杨树的线性转录本及其表达模式。主成分分析(PCA)显示线性转录本的生物重复具有很高的可靠性。

到目前为止，大多数用于植物circRNA鉴定的软件都是参考动物基因组开发的，由于植物基因组的复杂性，这可能会导致结果不恰当（图1A）。因此，研究人员开发了一种算法（图1B）过滤假阳性circRNA，如基于Find_circ获得的结果的方法中所描述的那样。用水稻的RNA-seq数据来评价算法的可用性，从经过RNase R处理和未处理的文库中得到的交叉circRNA都是阳性的circRNAs。结果表明，在Polya/Ribo-(未经RNase R处理)文库中，从487个circRNA中筛选出44个假阳性的circRNA和1个正确的circRNA。约10%(44/487)的假阳性circRNA被过滤掉，而未检测到跨度-外显子类型的假circRNA。研究人员进一步应用CIRI-Simulator建立的模拟RNA-seq数据库来检测假阳性的span-exon，发现了39个假阳性的circRNAs。新算法有效地过滤了各种类型的假阳性circRNA，几乎没有删除真正的circRNA。在上述分析中，默认参数是2，与Bowtie一致，导致低质量的假阳性circRNA没有被过滤掉。除了过滤之外，此脚本还可以注释CircRNAs的基因组位置。

针对108个杨树转录本经Find_circ软件鉴定和改良算法过滤后，胡杨、灰杨和白杨中分别保留了8,057，10,796和11,408个circRNA。研究人员随机选择了7个circRNA进行PCR和Sanger测序的实验验证。以聚合引物和发散引物同时扩增RNA和DNA作为对照。其中，5个circRNA被证实是通过反向剪接加工而来的（图2），而2条假阳性条带可能是由基因组中的小片段重复形成的。用qRT-PCR验证了circRNAs的表达水平，结果与测序结果一致。

 

 

图1. Find_circ软件鉴定的明显反向剪接(A)和circRNA过滤流程图(B)。

 

 图2. PCR和Sanger测序验证circRNA的有效性。A 用于验证circRNA(NW_011500042.1：341417_347948)的引物设计策略。B-E 四个circRNA的验证。

 

 

2   杨树circRNA的特性研究

 

       对候选circRNAs的注释表明，在3种杨树中由外显子区域转录的circRNAs比例最大，其余的主要来自内含子和基因间隔区，由外显子区域共转录的circRNAs较少（图3A），剪切供体与受体之间的距离导致circRNA长度集中在400bp以内（图3B）。考虑到不同样品的表达丰度不同，研究人员比较了不同物种、不同组织和不同盐浓度之间的表达水平（图3C）。大多数circRNA的表达水平较低，说明它们可能作为开关来行使调节功能。此外，类似于其他生物中的表达模式，circRNAs的组织特异性表达模式在杨树中广泛存在。

 

图3.杨树circRNA的特性研究。A 基因组特定区域产生的circRNA的百分比。B circRNA的长度范围分布。C 预测的circRNA在不同处理和四个组织下的表达水平。D circRNA的组织特异性表达模式。

 

3   杨树circRNA环化与方向相反的互补序列无关

 

       动物circRNA环化模型涉及内含子区域的反向互补对，而植物circRNA只有一小部分有内含子配对。为了探讨杨树的环化机制，利用含有上下游内含子序列的外显子circRNA进行BLAST反向互补序列检测。结果发现，胡杨(n=1)、灰杨(n=11)和白杨(n=9)的circRNA中分别只有0.08%、0.6.7%和0.52%含有互补的侧翼序列，说明这三种杨树circRNA环化与方向相反的互补序列无关。此外，研究人员还统计了较长的侧翼内含子序列，这些内含子序列通常与外显子circRNA的形成有关，在三种杨树中形成circRNAs通常由长的内含子组成。

 

4   杨树circRNA的保守性

 

       为了研究三种杨树circRNAs的保守性，研究人员根据全基因组序列确定了正交组，并进一步选择编码外显子circRNAs的同源基因进行下游统计分析（图4A）。结果表明，3种杨树中高度保守的circRNA约占36.7%，而在两种杨树中转录中度保守的circRNAs约占50%，只有1种杨树的circRNAs在30.70%~43.61%之间。高度保守的circRNAs比中度保守和特异的circRNAs表达量更高（图4B）。在棉花中，高表达的高度保守circRNA获得一个更长的内含子，以促进circRNA的循环，但在杨树中无论上游或下游的侧翼序列如何没有发现明显的正相关（图4C）。此外，研究人员还研究了亲本基因复制模式对产生保守circRNAs的贡献。结果表明，无论circRNAs的保守程度如何，它们的亲本基因大多是通过全基因组或片段复制的方式复制的（图4D）。

 

图4.杨树中的保守circRNA。A三种杨树的circRNA保守率及其定量。B三种杨树中特异型、中度保守型和保守型circRNA的表达水平。C侧翼内含子序列的长度分布。D不同保守水平的circRNA亲本mRNA的复制频率。

 

5 circRNA在起始位点和表达模式上的分化

 

        高度保守的circRNA可能通过不同起始位点影响非保守功能。编码锌指蛋白的ZAT10受活性氧诱导，与耐盐性有关。同源基因ZAT10-2的外显子是灰杨和胡杨中唯一能转录circRNAs的区域，而在白杨中，circRNAs只能从UTRs转录而来（图5A）。ZAT10-2基因circRNAs在盐诱导下的表达模式进一步证实了它们在抗盐中的功能（图5B）。此外，研究人员还分析了高度保守的circRNAs在不同组织和盐胁迫下的表达模式，发现了复杂的表达多样性（图5C）。所有高度保守的circRNA被分成三组，一个组织和一个盐度(在相同的组织和相同的盐浓度下表达的)，一种组织(在同一组织中表达，但在不同盐浓度下表达)，和两种组织(在不同组织中表达的组织)。其中，双组织所占比例最大，表明在特定处理/组织中表达的高度保守的circRNAs可能导致了三种杨树耐盐性的差异。

 

图5.三种杨树circRNA在起始位点和表达模式上的差异。

图5.三种杨树circRNA在起始位点和表达模式上的差异。A三种杨树zat10-2基因中circRNAs转录的位置。B由zat10-2基因产生的circRNAs在三种杨树不同组织和盐胁迫条件下的表达谱。C高度保守的circRNA在不同组织和盐浓度处理中的差异表达活性。

 

6   circRNA在功能上的分化

 

       CircRNA的功能可以通过它们的亲本基因的功能来解释，通过GO、KEGG和Pfam数据库注释了所有circRNA的亲本基因的一般功能。GO富集分析在“细胞代谢过程”、“生物调节”、“结合”、“有机环化合物结合”和“杂环化合物结合”功能显著富集。在KEGG分析中，最具代表性的途径包括剪接体、遗传信息处理和信使RNA生物起源等，与circRNA的形成机制一致。此外还富集了4个主要的Pfam类别，包括与RNA形成相关、对非生物胁迫的响应、激酶和转录因子（图6A），说明circRNAs的大量亲本基因与剪接和胁迫反应有关。为了评估在上述分析中参考亲本基因来确定circRNA功能是否合适，研究人员用皮尔逊相关法评估了circRNA与其亲本基因表达之间的相关性。结果表明，大约10%的circRNA表现出很强的相关性(|PCC|>0.9)，并且既存在正相关，也存在负相关，表明这些circRNA可能会影响它们的线性同源基因的表达。

 

       虽然Pfam数据库之外的circRNAs的功能在3种杨树中分别显示了不同的保守程度，但没有明显的差异（图6A）。进一步分析GO富集过程中与胁迫反应相关的亲本基因，并筛选出数目大于3个的蛋白质结构域。在三种杨树中，特定于该物种的区域类型有很大的不同（图6B）。白杨的物种特异性circRNAs有更多种类的结构域参与盐响应。研究人员还对盐响应DE circRNAs的潜在功能进行了研究。共鉴定出2159个DE circRNA，其中胡杨453个，灰杨618个，白杨595个。虽然大部分DE circRNAs存在于P.pruinose中，但当只涉及与胁迫反应相关的circRNAs时，白杨中DE CircRNAs最多，其次是灰杨和胡杨。研究人员进一步更详细地分析了这些分化的DE circRNA的特定功能。参与调节植物激素的白杨所特有的结构域ZF-RING_2属于circRNA GWHAEP00001389：20481-20745。另一个circRNA  NW_923084-923237在150 mM盐胁迫下下调了胡杨韧皮部EIN3结构域(胡杨特有的EIN3结构域)，调节乙烯反应。与非生物胁迫反应相关的circRNA 1225：35650-35783编码的转录因子RAP2-4-like在300mM盐胁迫下上调。

 

图6.三种杨树circRNA的功能分化。A通过Pfam数据库对所有circRNA的同源mRNA进行功能注释。B GO富集分析鉴定了三种杨树中具有胁迫响应功能的亲本基因的不同数量和结构域类型。C-D不同盐处理下DE circRNAs的分析。E 三种杨树亲本基因的逆境响应结构域类型及产生的DE circRNAs的比较。

 

 

7   胡杨盐胁迫相关circRNA包含miRNA结合位点

 

       植物circRNA的调节功能是通过竞争抑制miRNA的活性来扮演海绵的角色，导致miRNA靶基因表达的增加。本研究还构建了胡杨circRNA-miRNA-mRNA网络（图7）。在盐胁迫(200 mM短期和长期)和对照之间，分别有20和35个miRNAs在胡杨叶片中表现出一致的上调或下调。首先，利用在线软件psRNAtarget进行植物miRNA靶标分析，发现12753对circRNA-miRNA。其中，1089个circRNA具有1个以上的miRNA结合位点，14个circRNAs具有100个以上的miRNA结合位点，2个miRNAs可与100个以上的circRNA结合，说明潜在miRNA结合位点的circRNAs可能参与多种基因的转录后调控。第二、三种表达模式，包括上调的circRNA、下调的miRNA和上调的靶基因；下调的circRNA、上调的miRNA和下调的靶基因；上调的circRNA、上调的miRNA和上调的靶基因构建了候选共表达网络。共有15个circRNA含有miRNAs的结合位点（图7A）。GO富集结果表明，这些靶基因主要与细胞外周和氧化还原酶活性有关（图7B）。其中，已有12个基因通过实验鉴定为与盐胁迫有关的靶基因，如磷酸酶、钾通道、漆酶、ERKY转录因子、水通道蛋白和氧化酶。circRNA(NW_011499856.1:2204366-2204600) 来源于lncRNA(XR_841847.1)和mRNA(XM_011023008.1)之间的基因间隔区，在杨树中有两个保守的ptc-miRNA1444a结合位点，其靶基因被注释为含有磷酸酶2C和锌指AN1，并与植物的抗盐性有关（图7C）。

 

 

图7.胡杨中通过miRNAs调控的circRNAs网络。A三种表达模式构建候选共表达网络。B三种表达模式下与circRNA结合的miRNAs的靶基因GO富集。C circRNA的海绵功能示意图。

 

 

讨论

 

1   杨树circRNA的保守性

 

       一般来说，circRNAs在进化上是保守的，不仅是因为相似的基本特征，而且是因为在真核生物中的丰富表达以及在不同物种中产生circRNAs的部分同源亲本基因。从基本特征来看，杨树circRNA大多集中在400bp左右，主要转录于外显子区域。由于侧翼序列的配对率较低，所以circRNA的环化不受方向相反的互补序列的影响。在杨树中，能够产生circRNA的基因通常位于长内含子的两侧，类似于棉属植物。此外，研究人员还研究了三种杨树中产生circRNAs的部分同源基因。

 

2   circRNAs的分化为杨树响应逆境提供了一种可塑性策略

 

       虽然circRNA在进化上通常是保守的，但它们在组织/细胞类型/发育阶段的表达模式是特定的，亲本基因的表达丰度和衍生位点在细胞中起着重要作用。在三种杨树的circRNA表达模式是不同的，这可能推动了杨树耐盐性的多样化。circRNAs的衍生位点和数量在杨树对盐胁迫的响应中具有重要的调节功能。三种杨树中具有响应功能的亲本基因的物种特异性circRNAs的结构域类型也存在显著差异。这一结果与胁迫响应相关的DE circRNAs的鉴定结果是一致的，白杨的DE circRNAs最多。总之，circRNAs可能在多个水平上参与植物对逆境的反应。

 

3   胡杨circRNA的“海绵”功能

 

       circRNAs的“海绵”功能是真核生物中一种具有重要功能的调控机制。本研究中除了预测潜在的miRNA结合位点外，还考虑了circRNA的表达模式。研究人员发现了15个circRNAs预测的miRNAs结合位点，可以进一步调节对盐胁迫起作用的靶基因。

 

       本研究对杨树RNA的研究为耐盐适应的机制基础提供了新的见解。随着RNA编辑技术的发展，更多的circRNAs的功能和机制将被揭开，例如，植物中的circRNAs是否具有与动物相似的转录/翻译潜能，以及更多关于circRNA的形成、circRNAs与其亲本基因的关系、与其他非编码RNA的相互作用等方面的信息，所有这些方面都将揭开植物中circRNAs的神秘面纱。