基本信息

主题：NMT发现胞外ATP通过异源G蛋白、ROS、保卫细胞排Ca²⁺吸H⁺调节气孔开放

期刊：Molecular Plant

影响因子：12.084

研究使用平台：NMT植物免疫创新平台

标题：Extracellular ATP promotes stomatal opening of Arabidopsis thaliana through heterotrimeric G protein α subunit and reactive oxygen species

作者：河北师范大学尚忠林、郝立华、王伟霞、陈忱

检测离子/分子指标

Ca²⁺,H⁺

检测样品

拟南芥保卫细胞

近年来，三磷酸腺苷（ATP）作为一种信号分子存在于植物细胞的细胞器中。胞外ATP（eATP）在植物生长、发育和胁迫耐受性中起着重要作用。在这里，发现细胞外ATP在光照和黑暗中促进拟南芥的气孔开放。ADP、GTP和弱水解ATP类似物（ATPγS、Bz-ATP和2meATP）表现出类似的效果，而AMP和腺苷不影响气孔运动。乙酰酶抑制气孔开放。ATP促进的气孔开放被NADPH氧化酶抑制剂（diphenylene iodonium）或脱氧剂（dithiothreitol）阻断，在NADPH氧化酶的无效突变体（atrbohD/F）中受损。添加的ATP通过NADPH氧化酶触发保卫细胞中ROS的产生。ATP还诱导保卫胞中Ca²⁺的内流和H⁺的外排。在atrbohD/F中，ATP诱导的离子流速被强烈抑制。在杂合G蛋白α亚基的空突变体中，ATP促进的气孔开放、胞质ROS生成、Ca²⁺流入和H⁺外流均受到抑制。这些结果表明，eATP促进的气孔开放可能涉及异源G蛋白、ROS、胞质Ca²⁺和质膜H⁺-ATPase。

离子/分子流实验处理

        为了证实Ca²⁺参与保卫细胞中的eATP信号传导，使用非损伤微测技术（NMT）检测保卫细胞中的Ca²⁺流速。结果显示，0.6 mM ATP没有显著影响Ca²⁺流速（图1B）。Col-0的保卫细胞Ca²⁺流速在小范围内波动。当添加ATP后，Ca²⁺内流速率在1~2 min后开始增加，在约1 min内达到峰值，然后在随后的3~4 min内恢复到基础水平（图1C）。0.1、0.3、0.6 mM ATP诱导的Ca²⁺内流速率峰值逐渐增加（图1D）。

        为了证实H⁺-ATPase在eATP信号传导中的作用，利用NMT研究了ATP对保卫细胞中H⁺外排的影响。作为对照，在样品的测试液中分别加入MES缓冲液、AMP或ATP。结果显示，0.6 mM ATP对H⁺流速没有明显影响（图1F）。在ATP刺激2~3 min后，H⁺外排速率增加，在1 min左右达到峰值，然后在随后的3~4 min内恢复到对照水平（图1G）。0.1、0.3、0.6 mM ATP诱导的H⁺外排速率峰值逐渐增加（图1H）。

图1. ATP刺激拟南芥（col-0）保卫细胞的Ca²⁺内流和H⁺外排。正值代表Ca²⁺、H⁺外排，负值代表Ca²⁺、H⁺吸收。

        为了验证ATP刺激保卫细胞中Ca²⁺内流和H⁺外排的机制，以Gα和NADPH氧化酶的空突变体为植物材料，分别研究0.6 mM ATP对Ca²⁺内流和H⁺外排的影响。在gpa1-1和gpa1-2中，ATP没有促进Ca²⁺流入（图2A）。gpa1-1和gpa1-2的Ca²⁺内流速率峰值远低于野生型（P＜0.05）（图2B）。与col-0中显著的Ca²⁺内流相比，0.6 mM ATP仅能诱导atrbohD/F中微弱的Ca²⁺内流（图2C）。对0.6 mM ATP处理的响应，atrbohD/F中Ca²⁺内流的峰值速度明显低于野生型（P＜0.05）（图2D）。

        为了验证异源三聚体（Heterotrimeric）G蛋白和ROS在ATP刺激H⁺外排中的作用，研究了ATP对gpa1-1、gpa1-2和atrbohD/F中H⁺外排影响。两个突变体均未观察到相应野生型ATP刺激的H⁺外排。在gpa1-1和atrbohD/F中，0.6 mM ATP处理后H⁺外排速率仅略有增加（图2E, G）。ATP处理前后的H⁺外排速率峰值进一步证实Gα或NADPH氧化酶功能丧失导致缺乏对ATP的响应（图2F, H）。

图2. 异三聚体G蛋白和活性氧物质参与ATP刺激的Ca²⁺内流和H⁺外排。正值代表Ca²⁺、H⁺外排，负值代表Ca²⁺、H⁺吸收。

测试液

Ca²⁺：50 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 10 mM MES, pH 6.1
H⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.5 mM MES, pH 6.1

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