三. 生长发育

ABA

• 利用NMT进行脱落酸（ABA）研究的科研思路 160118

       去年10月底，中科院遗传发育所谢旗研究组发表在journal of experimental botany 上的研究成果，揭示脱落酸（ABA）接到植物开花的分子机理。abi4是ABA信号途径中一个正调控因子，前期研究发现，abi4突变体表现出早花的表型。研究随后以abi4为切入点，详细研究了ABA通过abi4调控开花时间的分子机理，证实abi4通过正调控开花关键基因flc的转录，进而负调控开花时间。abi4也是继abi5之后，在ABA途径上一个新鉴定到的调控开花的关键基因。

       

       ABA作为植物生理调控过程中最重要的信号分子之一，可抑制细胞分裂、促进叶果的衰老与脱落，并且直接调控气孔保卫细胞的开闭。研究者对检测活体植株ABA流速的需求一直非常旺盛，但分子流速电极的研发是世界性难题，旭月研究院也正在加紧研发之中。虽暂不可直接检测，但ABA在发挥其生理功能的过程中，与诸多离子有着密切的联系。

       ABA通过调节胞内H⁺浓度，调控外向K⁺通道，ABA也可以通过调节胞内IP2浓度，间接调控胞内Ca²⁺含量，从而影响细胞膜上的Cl^-、内向K⁺通道。而刚才提到的H⁺、K⁺、Cl^-、Ca²⁺，都是扬格/旭月非损伤微测系统能够直接检测的指标。遵循上述思路，同样处于研发之中的葡萄糖、H₂PO₄^-、Fe²⁺等指标，其利用NMT进行间接研究的方法便不难建立。

       

       目前，磷、脱落酸、乙烯、茉莉酸、铁等指标都已有利用NMT进行间接研究的科研成果，欢迎前往旭月非损伤论坛了解详情。

       参考文献：Kai S, et al. ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 4 negatively regulates flowering through directly promoting Arabidopsis FLOWERING LOCUS C transcription. J. Exp. Bot. 2016, 67(1): 195-205.

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• NMT已成为种子研究“经典方法” 161121

       种子休眠是植物应对不利环境的一种适应对策，并且能阻止作物的成熟种子在收获前萌发，以避免减产。相反，打破种子休眠则可以促进种子萌发，从而在作物种植和林业育苗中实现整齐出苗。

       十月底，国内非损伤微测技术（NMT）先行者、北京林业大学林金星教授，在Plant Physiology上，以杉木种子为研究对象，发表了最新研究成果。研究观察了杉木新成熟种子、12d低温层积处理种子、35℃储存40d种子休眠释放和诱导过程中，细胞学、基因表达和激素水平等方面的变化。结果显示，种子初生休眠释放期，蛋白体在胚胎细胞中合并，而在次生休眠诱导期间分离。初生休眠释放期间，负调控GA敏感性的基因显著下调表达；次生休眠诱导期间，正调控ABA生物合成的基因显著上调表达。在种子休眠释放和诱导期间，细胞学和基因表达的可逆变化与ABA/GA平衡有关。本研究为杉木种子生理休眠潜在的复杂调控机制具有重大意义，提供了人为调控种子休眠的新思路。

       

       图1 杉木种子生理休眠的调控机制和初生、次生休眠间的差异

       种子，是非损伤微测系统的理想研究对象，据NISC（NMT国际标准化委员会）文献库统计，中国学者在旭月研究院检测获得的种子离子/分子流成果，在世界范围内最为突出。其中，同为北京林业大学的汪晓峰教授，以及中国农科院的卢新雄教授，各自发文，检测了种子胚根，子叶等部位的H₂O₂、O₂流速，并最终利用O₂流速结果，建立了无损量化评价种子活力的新方法。

       

       图2 小麦、大豆、油菜种子，其不同部位的O₂流速

       此外，逆境研究方面，江苏师大孙健教授发现亚精胺可以提升种子耐水淹胁迫的能力。国外学者也对盐胁迫、植物毒素胁迫下，种子的离子/分子流进行了深入研究。

       参考文献：

       [1] Cao D., et al. Transcriptome and Degradome Sequencing Reveals Dormancy Mechanisms of Cunninghamia lanceolata Seeds. Plant Physiol, DOI:10.1104/pp.16.00384.

       [2] Li J, et al. The fluxes of H₂O₂ and O₂ can be used to evaluate seed germination and vigor of Caragana korshinskii. Planta, 2014, 239(6): 1363-1373.

       [3] Xin X, et al．A real-time, non-invasive, micro-optrode technique for detecting seed viability by using oxygen influx. Sci Rep, 2013, 3: 3057.

       [4] Liu M., et al. Spermidine Enhances Waterlogging Tolerance via Regulation of Antioxidant Defence, Heat Shock Protein Expression and Plasma Membrane H+-ATPase Activity in Zea mays. J Agron Crop Sci, 2014, 200: 199-211.

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IAA

• miRNA调控植物生长素信号途径的机制 150615

       植物领域国际期刊《The Plant Cell》于2015年3月20日在线发表了中科院微生物研究所郭惠珊课题组的最新研究。研究发现拟南芥中存在一个低水平表达的miRNA（miR847）受auxin诱导，miR847靶向并剪切下调Aux/IAA抑制蛋白IAA28的mRNA。本研究揭示了植物以IAA28蛋白的泛素化降解结合miR847/IAA28 mRNA调控模块实现auxin信号途径的快速去抑制化。

       

NMT潜在创新应用：

       IAA除了通过木质部与韧皮部的长距离运输外，还有如Transcellular、Apoplastic等短距离、胞外运输方式。经过了长期的试验及测试，旭月公司成功的研发出IAA电极，从而可以通过非损伤微测技术（NMT）准确地检测到活体内外的IAA交换信息。本研究中，Aux/IAA抑制蛋白IAA28的mRNA调控IAA的转运以及IAA与外环境交换的直接证据，有待利用NMT进行更深入的研究。

       Wang J, et al. Cleavage of INDOLE-3-ACETIC ACIDINDUCIBLE28mRNA by MicroRNA847 Upregulates Auxin Signaling toModulate Cell Proliferation and Lateral Organ Growth in Arabidopsis. Plant Cell,2015, 27:574-590.

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• 植物先天免疫机制与分离子流速 150817

       近日，《Plant Cell》在线刊登了中科院遗传发育研究所在植物先天免疫研究中取得的最新进展。病原细菌在侵染植物时需要分泌一系列效应蛋白到宿主细胞内，通过作用于特定靶点，改变植物的生理活动，以利于细菌的入侵或定殖。本文在研究丁香假单胞菌效应蛋白AvrB作用机理时发现，AHA1对气孔保卫细胞运动的调控是通过产生一未知信号，促进茉莉素受体COI1与转录抑制子JAZ的相互作用并增强茉莉素信号通路来实现的。

       

NMT潜在创新应用：

       在对效应蛋白AvrB的前期研究中发现，其通过与RIN4相互作用，正调控H⁺-ATPase AHA1的活性，从而导致气孔张开，以利于细菌的入侵。AHA1对气孔保卫细胞运动的调控是通过改变K⁺通道来实现的。上述研究中的茉莉素通过调节离子通道从而调控气孔的开度，国内学者已经通过NMT检测K⁺、Ca²⁺、H⁺的流速在生理功能水平上取得了直接证据。目前，国内的北京林业大学、河北师范大学利用NMT在气孔生理功能的研究上，已经走在了前列，前者更是率先将旭月IAA电极运用在茉莉素调节IAA信号通路的研究上，在SCI期刊上发表了国内首篇IAA流速检测文章。

       [1] Zhou Z, et al. An Arabidopsis PlasmaMembrane Proton ATPase Modulates JA Signaling and Is Exploited by thePseudomonas syringae Effector Protein AvrB for Stomatal Invasion.Plant Cell, 2015,27(7): 2032-2041.

       [2] Yan S, et al. The role ofplasma membrane H(+) -ATPase in jasmonate-induced ion fluxes and stomatalclosure in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 2015, 83(4): 638-649.（保卫细胞）

       [3] Hao L, et al. ExtracellularATP promotes stomatal opening of Arabidopsis thaliana through heterotrimeric Gprotein a subunit and reactive oxygen species. Molecular Plant, 2012, 5(4): 852-64.（保卫细胞）

       [4] Yan S, et al. MeJA AffectsRoot Growth by Modulation of Transmembrane Auxin Flux in the TransitionZonepaper. Journal of Plant Growth Regulation, 2015, doi/10.1007/s00344-015-9530-9.（IAA流速）

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花粉管

• 镁离子生物钟与镁流速——Nature研究启发新思路 160426

       4月中旬，英国爱丁堡大学及剑桥大学学者在Nature上发表了一篇名为《Daily magnesium fluxes regulate cellular timekeeping and energy balance》的研究论文。研究发现，Mg²⁺有助于控制细胞维持它们自己的时间节律来处理昼夜的自然环境周期。研究针对人类、藻类和真菌开展的实验发现，每种生物的细胞中，Mg²⁺水平在日周期节律中上升和下降。这不仅对细胞在一天中的代谢速率产生了巨大影响，而且还影响细胞自己的生物钟。

       

       在生物体中，不仅是离子浓度有周期性振荡现象，离子流速同样会有。胰岛B细胞O2内流速率振荡调控胰岛素分泌（Diabetes, 2000,49(9): 1511-6.）。花粉管H⁺、K⁺和Ca²⁺的振荡性内流延缓花粉管生长周期（J Cell Sci, 1999, 112: 1497-509.），Cl^-振荡性外流调控了花粉管生长和体积增大（Plant Cell, 2002, 14(9): 2233-49.）。同样，生物细胞Mg²⁺流动速率受[Mg²⁺]i变化影响，是否也存在节律及其特定的生理意义，值得我们利用非损伤微测技术继续深入研究。

       

       图注：胰岛B细胞O₂内流速率振荡

       目前，Mg²⁺流速检测已在光合研究中被广泛应用，国内学者利用扬格/旭月非损伤微测系统，已经实现了对叶绿体的无损检测。

       

       图注：非损伤微测系统检测活体叶绿体

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• 非损伤与微流控芯片 161031

       细胞迁移在血管再生、伤口愈合、炎症反应、胚胎发育等多种生理和病理过程中起到关键作用。细胞迁移研究中，传统的研究方法无法满足高通量的需求，且大多是单因素检测，难以综合考虑细胞基质、浓度梯度等多参数对细胞迁移的影响。

       微流控芯片分析是当前的科技前沿领域之一，其作为细胞迁移研究新的技术平台，一方面具有集成度高、灵敏度高、高通量、试剂消耗少等优势，快速实现大规模分析；另一方面芯片中微米级的通道结构可精确控制物质浓度梯度和微流体，调节溶液温度和pH等细胞微环境要素，更真实模拟细胞体内生长微环境，并完成实时监测。微流控芯片已经被广泛应用于细胞迁移研究，其模型分为二维(2D)和三维(3D)2大类，分别从平面培养和立体生长的角度，研究不同因子浓度梯度、电刺激或细胞间相互作用等条件对细胞迁移行为的影响，打破了传统方法的局限性，促进了生物及医学等领域的研究。

       近期来自中国科学院的研究人员介绍了微流控芯片在细胞迁移研究中应用的最新进展，重点综述了研究细胞迁移的2D和3D微流控芯片，并讨论了各类微流控芯片的优缺点。文章指出，微流控芯片特有的网格式通道结构、微米级尺寸、以及可同时在时间和空间上精确控制微流体等特点有利于更好模拟细胞体内真实生理环境。

       

       无伤口类细胞迁移的微流控芯片。(a) 竞争性物质梯度阵列芯片；(b) 单细胞迁移阵列芯片；(c) 电场可控型芯片；(d) 电化学组合型芯片

众所周知，NMT是测具体分离子流速的技术，而在此之前，有一种扫描振动电极技术（SVET），用于检测样品整体的电流。后来，随着技术的发展出现了NMT，可以具体检测到某种离子，精确研究形成电流的离子种类。

       

       萌发中的花粉管尖端Ca²⁺流动

       以植物花粉管研究为例，美国海洋生物学实验室的Jaffe教授在70年代利用电流密度测试发现花粉管发育过程中有较大电流出现，但是直到90年代才利用NMT证明该电流的形成90%是依靠Ca²⁺的流动，从而把机理研究推进了一大步。换言之，只有真正知道了是哪种离子或分子存在于该反应过程，才会对研究有本质上的帮助。

       总而言之，NMT是在芯片实验结果的基础上，进一步地研究其背后更加具体的信号变化。因为只有了解各离子间的相互关系，才能够真正阐明动植物生理过程中的机理机制。

       参考文献：

       [1] Liu W T, Chen H M, Nie F Q. Cell migration with microfluidic chips (in Chinese). Chin Sci Bull, 2016, 61: 364–373.

       [2] Kühtreiber WM, et al. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium- specific vibrating electrode. Journal of Cell Biology, 1990,110(5): 1565-1573.

       [3] Weisenseel MH, et al. Large electrical currents traverse growing pollen tubes. Journal of Cell Biology, 1975, 66(3): 556-567.

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根毛

• Ca²⁺流速——植物逆境信号传导新标志（一） 160516

       上周，第二届全国植物逆境生物学学术研讨会在青岛顺利召开。中国农大王毅、郭岩，中科院植物所种康，河南大学宋纯鹏，香港中文大学张建华等扬格/旭月非损伤微测系统的使用者，均在大会上就盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫、营养胁迫的最新研究进展做了报告。

Ca²⁺作为植物逆境中的重要信号分子，依旧备受瞩目。种康研究员将植物逆境Ca2+信号描述为“签字”。不同的逆境信号引发不同特征的Ca²⁺信号，犹如笔迹不一的“签字”。正是因为“签字”的笔迹不同，才引发植物对各类胁迫产生相应的生理反馈。

       低温胁迫

       中科院植物所种康研究组（Ma Y, et al. Cell, 2015,160(6): 1209-21.）在研究中发现，对水稻进行低温处理后，根部胞外Ca²⁺会迅速流入胞内，COLD1超表达水稻的Ca²⁺吸收尤为强烈，这是因为COLD1通过调控Ca²⁺激活水稻的抗寒响应。

       

       图1. 不同品种、基因型水稻在低温胁迫下，根部Ca²⁺的流速。正值表示外排，负值表示内流。

       高温胁迫

       北京林业大学陈少良研究组（Yu Y, et al. Plant Cell Tiss Org, 2016, 125(2): 215-230.）高温处理胡杨细胞时发现，胞外Ca²⁺会迅速流入胞内，并在6h后开始外排。采用质膜Ca²⁺-ATPase抑制剂处理后，Ca²⁺外 排现象消失。表明高温胁迫下，质膜Ca²⁺-ATPase参与调控Ca²⁺转运。

       ]

       图2. 高温胁迫后24h内，胡杨细胞Ca²⁺流速变化情况。正值表示外排，负值表示内流。

       重金属胁迫

       中科院植物所张海燕副研究员（Fan J., et al. J Plant Physiol, 2011, 168: 1157-1167.）研究了重金属Cd2+对拟南芥根毛的影响，发现Cd²⁺在抑制胞外的Ca²⁺流入胞内的同时促进了胞内Ca²⁺外流，扰乱了胞内Ca²⁺浓度梯度，干扰囊泡转运，导致细胞壁出现异常。

       南京大学赵福庚研究组（Li S, et al. Plant Cell Environ, 2012, 35(11): 1998-2013.）同样发现，重金属Cd²⁺能诱导水稻细胞的去极化，阻碍细胞对Ca²⁺和K⁺的吸收，扰乱了胞内的Ca²⁺/K⁺平衡。

       

       图3. CdCl₂处理前后，根毛尖端Ca²⁺流速。正值表示外排，负值表示内流。

       铝胁迫

       康奈尔大学的Leon教授（David L. Jones, et al. Planta, 1995, 197(4): 672-680.）研究了Al对沼萍根毛Ca²⁺流动的影响，发现高/低浓度（20/2 μM）Al均能够抑制沼萍根毛发育，但只有高浓度的Al抑制了根毛尖端Ca²⁺的内流。这一研究结果表明，Al只能影响根毛质膜及胞内的若干位点，从而抑 制根毛生长。

       

       图4. 沼萍对照组、Al胁迫组根毛各位点Ca²⁺流速。正值表示内流，负值表示外排。

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种子

• 种子保存难题导致捕虫水生植物面临灭绝困境 160328

       拥有捕虫夹的植物中，最出名的莫过于热带植物猪笼草。因其拥有一个独特的吸取营养的器官——捕虫笼而显得与众不同。而今天的主角——囊泡貉藻，是已知利用像颌一样的捕虫夹抓住猎物的唯一水生植物，它曾令查尔斯•达尔文异常着迷。囊泡貉藻顶部的捕虫夹是植物王国中移动最为迅速的附属物之一。当小型无脊椎动物落上去时，它们仅用10毫秒便能将其抓住。而现在，囊泡貉藻已经处于灭绝的危险之中。

       首先是栖息地破坏和非法采集，导致过去一个世纪，它的个体密度下降了近90%。而当植物学家们试图利用保护植物的常规方法——种子库，来保护其免受灭绝危险时，却遇到了极大的难题。研究人员在不同条件下将它们储存了1年，以观察其能否发芽。一些种子在超过结冰点的温度下被埋进钢丝网包的土壤中，以模拟自然状态下的种子库。其它种子则在-18℃下被放在密封袋中，以复制人造室内种子库。结果发现，对于被存放在超过结冰点温度下的种子来说，仅有12%在1年后仍能发芽，大多数都受到真菌破坏。这意味着囊泡貉藻保护工作要比建立传统的种子库花费更高，而且在技术上面临着更大风险。

       种子活力是反映种子发芽率及萌发所形成植物的健壮度的量化指标，种子活力越高，种子的利用价值则越大。因而提升种子活力检测步骤的效率，在一定程度上可以有效地促进囊泡貉藻种子库建立。2015年，旭月公司取得了名为“一种通过氧气流速判别种子活力的方法”（专利号ZL201210462127.6）的发明专利，即通过非损伤微测技术（NMT），测量种子O₂流速值的大小来判别被测种子的活力，可在保证种子不受破坏性处理的情况下，测量出单独一粒种子的活力。此项检测对种子无损伤，不影响后续使用，有效克服了传统活力检测方法只能得出统计结论而无法给出单粒种子的活力、测量后的种子无法继续使用等缺陷。

       

       图注：不同活力的种子，其不同部位的O₂流速。

       [1] Xin X, et al. A real-time, non-invasive, micro-optrode technique for detecting seed viability by using oxygen influx. Sci Rep, 2013, 3: 3057.

       [2] Li J, et al. The fluxes of H₂O₂ and O₂ can be used to evaluate seed germination and vigor of Caragana korshinskii. Planta, 2014, 239(6): 1363-1373.

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• NMT已成为种子研究“经典方法” 161121

       种子休眠是植物应对不利环境的一种适应对策，并且能阻止作物的成熟种子在收获前萌发，以避免减产。相反，打破种子休眠则可以促进种子萌发，从而在作物种植和林业育苗中实现整齐出苗。

       十月底，国内非损伤微测技术（NMT）先行者、北京林业大学林金星教授，在Plant Physiology上，以杉木种子为研究对象，发表了最新研究成果。研究观察了杉木新成熟种子、12d低温层积处理种子、35℃储存40d种子休眠释放和诱导过程中，细胞学、基因表达和激素水平等方面的变化。结果显示，种子初生休眠释放期，蛋白体在胚胎细胞中合并，而在次生休眠诱导期间分离。初生休眠释放期间，负调控GA敏感性的基因显著下调表达；次生休眠诱导期间，正调控ABA生物合成的基因显著上调表达。在种子休眠释放和诱导期间，细胞学和基因表达的可逆变化与ABA/GA平衡有关。本研究为杉木种子生理休眠潜在的复杂调控机制具有重大意义，提供了人为调控种子休眠的新思路。

       

       图1 杉木种子生理休眠的调控机制和初生、次生休眠间的差异

       种子，是非损伤微测系统的理想研究对象，据NISC（NMT国际标准化委员会）文献库统计，中国学者在旭月研究院检测获得的种子离子/分子流成果，在世界范围内最为突出。其中，同为北京林业大学的汪晓峰教授，以及中国农科院的卢新雄教授，各自发文，检测了种子胚根，子叶等部位的H₂O₂、O₂流速，并最终利用O₂流速结果，建立了无损量化评价种子活力的新方法。

       

       图2 小麦、大豆、油菜种子，其不同部位的O₂流速

       此外，逆境研究方面，江苏师大孙健教授发现亚精胺可以提升种子耐水淹胁迫的能力。国外学者也对盐胁迫、植物毒素胁迫下，种子的离子/分子流进行了深入研究。

       参考文献：

       [1] Cao D., et al. Transcriptome and Degradome Sequencing Reveals Dormancy Mechanisms of Cunninghamia lanceolata Seeds. Plant Physiol, DOI:10.1104/pp.16.00384.

       [2] Li J, et al. The fluxes of H₂O₂ and O₂ can be used to evaluate seed germination and vigor of Caragana korshinskii. Planta, 2014, 239(6): 1363-1373.

       [3] Xin X, et al．A real-time, non-invasive, micro-optrode technique for detecting seed viability by using oxygen influx. Sci Rep, 2013, 3: 3057.

       [4] Liu M., et al. Spermidine Enhances Waterlogging Tolerance via Regulation of Antioxidant Defence, Heat Shock Protein Expression and Plasma Membrane H+-ATPase Activity in Zea mays. J Agron Crop Sci, 2014, 200: 199-211.

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