NMT应用

NMT应用

NMT应用概述

    非损伤微测技术（NMT）是一种在不损伤样品的情况下，快速原位获取离子/小分子跨膜转运信息的技术。它自从诞生以来，就受到了世界各地的科学家的注意，并逐步应用于生命科学，生态科学以及材料科学的众多领域。

    目前非损伤微测技术（NMT）应用的领域已经涵盖植物学，动物学，微生物学，医学，环境科学，材料科学，农业技术等。非损伤微测技术（NMT）已成为生命科学研究功能的重要工具，非损伤微测系统也已发展成为生命科学研究实验室研究功能的必备工具。

    迄今为止，利用非损伤微测技术（NMT）在世界范围内已经发表SCI论文超过350篇，而其中值得关注的是，国内科研工作者在NMT技术2005年进入中国以来，短短的8年的时间，累计发表的文章已经超过了全世界范围的全部文章的20%。这一数据足以说明，中国已经成为NMT技术应用的大国，相信随着科研水平的不断发展，NMT技术会被广大科研工作者应用于更广泛的领域，更深入的研究中。

NMT应用常问解答

非损伤微测技术已经应用在哪些领域中了？

• 非损伤微测技术测定的指标包括电压、电流、浓度、流速和方向，因此可以应用的领域非常广泛。
  

• 目前可以成熟测定离子和分子有：Pb²⁺、H⁺、Ca²⁺、Na⁺、K⁺、Cl^-、Mg²⁺、Cd²⁺、NH₄⁺、NO₃^-、IAA、O₂、H₂O₂。
  

• 这些离子涉及到基本的物质组成和生物学功能，因此可以应用在植物学、动物学、微生物学、医学、环境科学、材料科学等领域。
  

应用非损伤微测技术已经做了哪些研究？

• 重金属污染与治理机理研究
  
• 生态环境监测与分析
  
• 植物与微生物相互作用研究
  
• 光合/呼吸作用研究
  
• 植物营养研究
  
• 植物逆境研究
  
• 植物发育调控研究
  
• (干)细胞凋亡检测与研究
  
• (干)细胞活性检测与研究
  
• (干)细胞及组织生理调控研究
  
• 肿瘤药理研究与药效评价
  
• 糖尿病、肿瘤、老年痴呆症等疾病研究
  

应用非损伤微测技术需要哪些准备？

    非损伤微测技术的仪器易于操作，测定过程直观可视化，准备起来相对其他实验要简单，最重要的是需要一个好的实验设计，然后准备实验材料，摸索或者设计好测试体系，然后就可以获得数据。因此，进行生物材料的实验时需要准备的主要有三个方面：

1. 实验设计：需要对实验有深刻的认识，了解离子流速和分子流速在研究中的作用，设计合理的实验对照和实验过程说明要解决的问题。
2. 实验材料。
3. 测试体系：即测定时材料所处的液体环境。
   

中国科学家使用非损伤微测技术的文章都刊登在哪些杂志？

• Science

• Nature

• Plant Cell

• Plant Physiology

• Plant, Cell and Environment

• New Phytologist

• Analytical Biochemistry

• Physiologia Plantarum

• FEBS Journal

• Neurogastroenterology and Motility

• Mycorrhiza

• Journal of Plant Physiology

• Journal of Agronomy and Crop Science

• Tree Physiology

• Planta

• Journal of Integrative Plant Biology

• BMC Plant Biology

• Journal of Biological Chemistry

• Plant Signaling & Behavior

• World Journal of Gastroenterology

• Journal of Proteome Research

• Molecular Plant

• 科学通报

• Environmental Science & Technology

• Ecotoxicology and Environmental Safety

• Bioresource Technology

• PLoS ONE

• Physiologia Plantaru

• Journal of Experimental Botany

• British Journal of Pharmacology

• Chinese Medical Journal

• Biochemical Pharmacology

• Plant Cell Reports

• Plant Cell

• Tissue and Organ Culture

NMT应用领域

植物研究应用

（1）蛋白功能研究 分子伴侣通过蛋白激酶调控质膜H⁺-ATPase的活性
    北京生命科学研究所的郭岩研究组使用非损伤微测技术对拟南芥根部的H⁺流进行了原位活体测量，证实了分子伴侣J3、蛋白激酶PKS5及质膜H⁺-ATP酶相互作用对植物适应逆境的影响，文章发表于植物学最高水平杂志《Plant Cell》。文中提到的Microelectrode Ion Flux Estimation技术是非损伤微测技术的一种。

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Yang YQ, et al. Plant Cell, 2010, 22: 1313 - 1332.

（2）植物抗逆的研究 离子流的转换对胡杨抗盐起到关键作用
    北京林业大学陈少良研究组使用非损伤微测技术研究了胡杨（抗盐品种）和群众杨（盐敏感品种）根部和根原生质体在盐胁迫下的Na⁺、H⁺、Cl^-流的变化情况，发现胡杨抗盐的机制在于其根部质膜上具有高活性的Na⁺/H⁺逆向蛋白和较强的离子转运能力。

Sun J, et al. Plant Physiology, 2009, 149: 1141 - 1153.

（3）植物生长发育的研究 钙调素引发Ca²⁺的内流
    中国科学院植物研究所林金星研究组使用非损伤微测技术研究了白芊花粉管的Ca²⁺流，发现白芊花粉管生长过程中对钙调素（Ca²⁺-calmodulin）分子的抑制会引发Ca²⁺内流的改变，进而改变胞内Ca²⁺浓度导致花粉管的畸形。这是对钙调素分子功能的全新认识。

Chen T, et al. Plant Physiology, 2009, 149: 1111 - 1126.

微生物学研究应用

菌根化过程的信号转导机制

    葡萄牙的Feijó实验室使用非损伤微测技术研究了离子流在菌根生长过程中的作用，发现真菌侵染主要作用于根部伸长区，离子运动及根部酸化发生了剧烈变化，且离子流变化呈现周期性。通过这项研究他们构建模型解释了植物养分吸收和生长加速是通过侵染真菌所介导，依赖于pH的变化，发现Ca²⁺在这一过程中发挥了重要的作用，这为揭开植物和真菌共生互作提供了证据和模型。

Ramos AC, et al. New Phytologist, 2009, 181: 448 - 462.

神经学研究应用

（1）Bcl-x_L通过与线粒体F₁F₀ ATP合成酶的相互作用调节神经元代谢的效率

    B细胞淋巴2（Bcl2）家族蛋白调节程序性细胞死亡，但是抗细胞程序性死亡蛋白如Bcl2和Bcl-x_L如何阻止细胞死亡的过程还不了解。Bcl-x_L促进线粒体和胞质之间代谢物的交换，也是成年大脑中主要的抗细胞程序性死亡的蛋白，Bcl-x_L过表达增加了突触的数量和大小。

    为了研究Bcl-x_L的调节作用，耶鲁大学的科学家使用非损伤微测技术在“Nature Cell Biology”发表文章，发现过表达Bcl-x_L的神经元有更高的ATP水平，外源Bcl-x_L减少或者抑制ATP。尽管ATP水平增加，但是过表达神经元Bcl-x_L的耗氧降低，且Bcl-x_L消失后增加了氧气吸收的水平。证据表明Bcl-x_L与F₁F₀ ATP合成酶的β-subunit直接作用，减少了F₁F₀ATP成酶复合体中的离子渗漏，因而增加了F₁F₀ATP活动期间通过F₁F₀的H⁺转运。此外，重组Bcl-x_L蛋白直接增加了纯化的合成酶复合体ATPase活性的水平，并且外源的Bcl-x_L减少了F₁F₀酶活性的水平。发现表明在Bcl-x_L表达的神经元中增加线粒体的效率归功于增加了突触的效能。

    本研究认为Bcl-x_L通过减少质子从F₁F₀ATP酶的渗漏增加ATP合成酶的效率，因此促进了神经元的代谢。这里通过非损伤微测技术直接测定神经元的氧气流速，从而准确地认识了Bcl-x_L所引起的线粒体代谢效率的增加，为更多的代谢方面的研究提供了新手段。

Kambiz N. Alavian, et al. Nature Cell Biology, 2011, 13: 1224–1233.

（2）老年痴呆症治疗的新思路

    阿尔茨海默病(Alzheimer病，AD)是引起老年痴呆的重要疾病，AD的主要病理学特征是胞外不溶性β淀粉粒(Aβ)空斑的沉积。研究表明Aβ的聚集受金属锌及铜的催化。金属硫蛋白（MT）是脑内主要的锌和铜的内源结合蛋白，MT与AD的病理生理学相关。鉴于MT较强的金属结合能力，研究人员推测 MT可能参与调控金属结合调控及Aβ聚集。

    2010年，澳大利亚及爱沙尼亚的科学家以大鼠皮质神经元细胞为材料，通过电喷雾离子阱质谱（ESI-MS）、等离子体质谱（ICP-MS）、神经元毒性试验、非损伤微测技术等手段研究了金属硫蛋白亚型MT-2A与锌/铜的结合状态以及不同处理条件下神经元细胞的活力、Ca²⁺、K⁺离 子流信息等。研究发现，MT-2A可以保护皮质神经元细胞免受Aβ聚集引起的毒性，主要是由于Zn7MT-2A与Cu(II)Aβ之间的锌铜交换并形成 Zn结合的Aβ，而Zn结合的Aβ只能形成可溶性的可溶性的蛋白聚集。神经元毒性试验表明Cu(II)Aβ具有神经元毒性，可诱导产生类似氧化胁迫的不利 影响。通过非损伤微测技术检测Cu(II)Aβ处理下神经元离子动态平衡的改变，发现Cu(II)Aβ引起K⁺的外流，Ca²⁺的内流，而加入5μM的Zn7MT-2A会阻止Cu(II)Aβ引起的K⁺和Ca²⁺流的改变，证实了Zn7MT-2A可阻止Cu(II)Aβ诱导氧化胁迫引起的不利影响。

    目前比较普遍的AD疗法是金属螯合疗法，但是被螯合掉金属离子的Aβ容易重新与金属离子结合，而MT与Aβ进行金属交换后留下的是活性低的结合了锌的Aβ。该研究结果提供了一种更为可行的AD金属螯合疗法。

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    注：Cu(II)-Aβ及Zn7MT-2A处理下的Ca²⁺、K⁺离子流信息。Cu(II)Aβ引起K+外流，Ca²⁺内流，而Zn7MT-2A阻止Cu(II)Aβ引起的离子流的改变。

Chung RS, et al. (2010). PLoS ONE 5(8): e12030. doi:10.1371/journal.pone.0012030

动物学研究应用

青鳉幼鱼线粒体富集细胞NH₄⁺的吸收依赖于Na⁺的吸收

    中国台湾的科学家使用非损伤微测技术对青鳉幼鱼皮肤表面线粒体富集细胞（MRCs）的H⁺、Na⁺和NH₄⁺的流速进行了测定，发现Na⁺/H⁺交换器（NHE）与Na⁺和NH₃/NH₄⁺的转运相关，提高胞外的NH₄⁺浓度显著抑制NH₃/NH₄⁺的分泌和Na⁺的吸收。相反，提高溶液的酸性可增强细胞对NH₃/NH₄⁺的吸收和Na⁺的分泌。Na⁺的吸收与NH₃/NH₄⁺的外排是通过淡水鱼的MRCs实现，也说明了与斑马鱼通过HRCs细胞对Na⁺的吸收作用机制不同。

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Wu SC, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2010, 298: C237 - C250.

医学研究应用

（1）骨骼研究 骨骼作为离子交换的器官
    《Bone》杂志报道了几位科学家使用非损伤微测技术测定生理状态下骨骼的Ca²⁺流，发现Ca²⁺在EFC溶液中出现内流，在无Ca²⁺的ECF溶液中出现外流，这种内外流的转变在整个实验期间都非常稳定。当添加10mM 的NaCN时，10min之内Ca²⁺外流消失，说明这种外流具有细胞依赖性。这项研究为我们理解Ca²⁺在骨骼和胞浆中的平衡提供了依据，可以据此为人体补钙。

Marenzanaa M., et al. Bone, 2005, 37: 545 - 554.

（2）伤口愈合 电流激活伤口愈合的信号通路
    加州大学的赵敏实验室使用非损伤微测技术研究了内生伤口的电流，测定了Na⁺、K⁺和Cl^-电流，发现电信号通过激活特定的酶，可以调控伤口愈合过程中细胞的迁移，并选择性地激活信号通路。

Zhao M, et al. Nature, 2006, 442: 457 – 460.

环境科学研究应用

鱼胚胎耗氧作为环境监测的指标

    普渡大学的科学家使用非损伤微测技术检测了鱼胚胎的O₂流，发现在微量有机污染物作用下，鱼类胚胎O₂内流量会显著降低。这是真正意义上的环境污染生物学监测手段，表明污染物的作用可能比原先预计要严重的多。这项技术可用于其他有机生命体，如果将胚胎鱼结合使用于瘤细胞，能够检测到潜在的致癌药物，或帮助发现新的治疗目标。这项研究非常令人欣慰，它能够成为保护人类健康的一项潜在应用工具。该研究采用非损伤微测技术来监测环境毒物的存在，为水质监测提供了新的思路和方法。

Sanchez BC, et al. Environmental Science & Technology, 2008, 42: 7010 - 7017

与其他技术的结合

（1）与膜片钳技术的结合

离子通道调节细胞凋亡早期的K⁺外流

墨西哥和澳大利亚的科学家使用非损伤微测技术和膜片钳技术研究了细胞凋亡，发现1μM STS（十字孢碱）会快速引起K⁺外流，同时记录到Kbg通道的电流增加，伴随着膜去极化的急剧下降。Kbg通道调节早期的K⁺外流，Kv1.3通道在后期起到主要作用。这一研究为认识细胞凋亡的内在机制提供了新的证据，这种实时和便于操作的研究手段有望在临床等实际应用领域诊断或检测凋亡细胞。

Valencia-Cruz G, et al. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2009, 297: C1544 - C1553.

（2）与荧光/激光共聚焦技术的结合

胞外的Ca²⁺内流参与了胞内Ca²⁺的增加

葡萄牙的Feijó实验室使用激光共聚焦显微镜技术测定了细胞内Ca²⁺的同时结合使用非损伤微测技术测量了进出细胞的Ca²⁺流。细胞融合一旦发生，使用非损伤微测技术测得一个显著的Ca²⁺内流，直接验证了胞外的Ca²⁺的参与了胞内Ca²⁺的升高这一生理过程。

Antoine AF, et al. Nature Cell Biology, 2001, 3: 1120 – 1123.